客員教授 津下 英明

2008/04/01
学位
博士(理学) 北海道大学
専門分野
生体高分子、蛋白質構造解析、構造生物学
職  歴
1987年 北海道大学理学部高分子学科卒業
1989年 北海道大学大学院理学研究科高分子学専攻修士課程修了
1989年 JT生命科学研究所 研究員
1993年 北海道大学理学部理学研究科高分子学専攻 博士(理学)
1994年 Agouron Pharmaceuticals Inc. 研究員
1997年 徳島文理大学・健康科学研究所 助教授
2002年 理化学研究所 播磨 構造生物物理 客員研究員(現在にいたる)
2002年 徳島文理大学・健康科学研究所 教授(2010年まで)
                   健康科学研究所・生体分子構造学部門長(2010年まで)
2003年 徳島大学・分子酵素学研究所センター 客員教授(2009年まで)
2009年     第45回 徳島新聞賞 科学賞
研究要旨
生命の仕組みを原子レベルで明らかにし理解をするために我々の研究室では蛋白質X線結晶解析を主な手段として生体高分子の構造を解析している。今後の研究の中心は複合体の結晶構造を明らかにすることで生物に学び、さらに蛋白質自己集合体のデザインを行っていこうとしている。
(1)感染症の構造生物学
我々のグループは様々な外部機関との共同研究により感染症の解明のために生化学と構造生物学を進めている。モノADPリボシル化は1968年に本庶、西塚、早石によりジフテリア毒素の作用機序として始めて発見された。ガス壊疽菌Iota毒素は酵素ユニットIaと膜上でオリゴマーを形成して毒素を細胞内に入れるIbからなる。IaはアクチンのArg177を特異的にADPリボシル化することでアクチンの重合阻害をし、細胞のラウンディングを起こす。我々は、このIaの結晶構造をNAD結合型で明らかにした(Tsuge et al. (2003) JMB)。二つの繰り返しドメインからなり、このC末端のドメインにNADを結合する。いくつかのアクチン特異的ADPRTの立体構造は解析されてきたが、基質タンパク質との複合体が得られていないために両者の結合モードおよびその反応機構は不明であった。この研究をさらに進めるために非水解性のNAD類似化合物βTADを用いIa-actin-βTADの高次複合体結晶化を行った。得られた小さな薄い板状の結晶を用いてシンクロトロンで2.8Aのデータを得て、アクチン-Ia-βTADの複合体構造を明らかにした。(Tsuge et al. (2008) PNAS )。IaにはβTADを、またアクチン中にはATPとLatrunculin Aを含む。IaはβTAD結合の周りの5つのループでアクチンと結合する。予想外な点はNドメインのループもアクチンとの結合に関与していた事である。複合体のIaとアクチンの構造はモノマーと比較して大きく変化はない。複合体構造より反応機構が推定された。第1中間体であるオキソカルベニウムイオンの生成を経てさらにNO5-NC5のトーションの回転によりADPリボシル基のNリボースがArg177に近づく第2中間体を経由してSN1で反応が進行すると考えられる。また第2中間体形成にアクチン側のAsp179がNリボースの固定で重要な役割をする。この研究はThis week in PNASでトピックスとして紹介された。またヘリコバクターピロリのTNF誘導タンパク質〈Tipα〉の構造を明らかにした(Tsuge et al. (2009)BBRC)。パンデミックとして注目されているインフルエンザAウィルス、このRNA ポリメラーゼのヒトからヒトへの感染で重要なK627を含むドメインの構造とそのRNA結合への関与を明らかにした(Kuzuhara et al. (2009)JBC)。Aeromonas Sobria の敗血症因子であるkexin様のプロテアーゼの構造とその特徴を明らかにした(Kobayashi et al. (2009)JBC).

(2)タンパク質-タンパク質相互作用理解
近年我々の研究室で得られた大きな成果は超好熱アーキアのL-プロリン脱水素酵素(PDH)複合体である。超好熱アーキアにはサブユニット構造はα(56 kda)とβ(43 kda)が複合体を形成し、これが4組集まったヘテロ8量体をとるPDH1(分子質量:440 kDa)とα(54 kDa)、β(43 kDa)、γ(19 kDa)、δ(11 kDa)の4種のサブユニットからなる複合体(120 kDa)をとるPDH2が存在する。Pyrococcus  horikoshii由来のPDH1の構造を初めて解析し、新規のジフラビン酵素ファミリーの構造を明らかにした。コファクターとしてβサブユニットにFAD, αβサブユニットの境界にFMNがさらにαサブユニットに ATPの結合を持つ。既に多くの研究がなされてきた一酸化窒素合成酵素(NOS) やp450 還元酵素(CYPOR)とはそのFAD、FMNの配向は異なり、その電子およびプロトンの伝達は異なると考えられる。PDHと一次構造上相同性が高いザルコシン酸化酵素はモノマー型、すなわちβサブユニットだけのMSOXと、αβγδサブユニットからなるヘテロテトラマー型のTSOX が存在する。TSOXはザルコシン酸化の時に得られたイミンを用いてH4葉酸存在化で5,10-CH2-H4葉酸を作るバイファンクショナルな酵素であり、このTSOXの構造が2つのグループにより明らかにされた(Ida et al. (2005)BBRC, Chen et al. (2006) JMB))。PDH1とTSOXのそれぞれのαβサブユニットは相同で、diflavinの位置関係は2つの酵素でよく保存されている。また、両者とも機能は未知であるが、PDH1ではATP がTSOXではNADが同じ位置に結合している。PDH1とTSOXは新たなジフラビン還元酵素のファミリー形成している。 (1Y56)(徳島大学、工学部、櫻庭および大島との共同研究)

(3) スフィンゴミエリン代謝系酵素の結晶構造解析
スフィンゴミエリン代謝系酵素群の構造生物学は現在までほとんど行われていない。我々はスフィンゴミエリンからセラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン1リン酸を作る酵素、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、スフィンゴシンキナーゼ等の構造生物学、細胞生物学を徳島文理大学,薬学部、櫻井との共同で進めている。食中毒菌として知られているセレウス菌(Bacillus cereus)由来のスフィンゴミエリナーゼ(Bc-Smase)は、赤血球を破壊する溶血活性を持ち、脂質メディエータ産生酵素のヒト由来nSMaseに類似の酵素である。Bc-SMase はnSMaseと同様にスフィンゴミエリンを加水分解してセラミドとフォスフォコリンを生産して、細胞の分化、老化、アポトーシスを引き起こす。このため、nSMaseのリン酸エステル加水分解活性の触媒メカニズムは、生物種を超えて共通であると考えられる。Bc-SMaseの触媒メカニズムの研究は、バクテリアにとどまらずヒトnSMaseの働きを解明する上で重要な情報を与える。徳島文理大学薬学部小田・櫻井および理研播磨放射光科学総合研究センター吾郷・宮野との共同研究により、金属イオンの役割を始めとするBc-SMaseのリン酸エステル加水分解活性の詳細を1.4Å分解能で明らかにした。

(4)タンパク質構造から創薬へ
カテプシンLの特異的阻害剤CLIK148を用いてその構造と似たパパインとの複合体での結晶化に成功し結合モードを1.7A分解能で明らかにした。カテプシンBの阻害剤CA074とは反対の結合モードである事が明らかになった。CLIK148はカテプシンBの阻害剤CA074と共にCLIK148は臨床応用への研究とともに各種カテプシンの役割を知るためのツールとして世界中の研究室で使用されている。(徳島文理大学・健康科学研究所・勝沼との共同研究)(1CVZ)

主 要 論 文
1) "Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue."
Kuzuhara T, Kise D, Yoshida H, Horita T, Murazaki Y, Nishimura A, Echigo N, Utsunomiya H, Tsuge H.
J Biol Chem. 2009 284(11):6855-60.
2) “Structural basis of actin recognition and arginine ADP-ribosylation by Clostridium perfringens iota-toxin”
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105(21):7399-404.
Tsuge, H., Nagahama, M., Oda M., Iwamoto, S., Utsunomiya, H., Victor, E.M., Katunuma, N., Nishizawa, M. and Sakurai, J.
3) “Crystal structure of a novel FAD-,FMN-, and ATP-containing L-Proline Dehydrogenase Complex from Pyrococcus horikoshii”
J. Biol. Chem. 2005 280(35):31045-31049
Tsuge, H. , Kawakami, R., Sakuraba, H., Ago, H., Miyano, M., Aki, K., Katunuma, N. and Ohshima, T.
4) .“Crystal structure and site directed mutagenesis of enzymatic components from Clostridium perfringens iota-toxin”
J. Mol. Biol. 2003 Jan 17;325(3):471-483
Tsuge, H. , Nagahama, M., Nishimura, H., Hisatsune, J., Sakaguchi, Y., Itogawa, Y.1, Katunuma, N. and Sakurai, J.
5) “Inhibition mechanism of Cathepsin L specific inhibitors based on the crystal structure of papain-CLIK148 complex ” BBRC, 266, 411-416(1999)
Tsuge,H., Nishimura, H., Matsui, A., Murata, E., Turk, D., Turk,V., Tada, Y., Asao, T. and Katunuma, N

最近5年間の論文リスト(2005〜2009)
1) "Structural basis for the kexin-like serine protease from Aeromonas sobria as a sepsis-causing factor."
Kobayashi H, Utsunomiya H, Yamanaka H, Sei Y, Katunuma N, Okamoto K, Tsuge H.
J Biol Chem. 2009
2) "Structural basis for the Helicobactor pylori-carcinogenic TNF-alpha-inducing protein."
Tsuge H, Tsurumura T, Utsunomiya H, Kise D, Kuzuhara T, Watanabe T, Fujiki H, Suganuma M.
Biochem Biophys Res Commun. 2009
3) "Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue."
Kuzuhara T, Kise D, Yoshida H, Horita T, Murazaki Y, Nishimura A, Echigo N, Utsunomiya H, Tsuge H.
J Biol Chem. 2009 284(11):6855-60.
4) Tsuge H., Nagahama M., Oda M., Iwamoto S., Utsunomiya H., Victor E.M., Katunuma N., Nishizawa M. and Sakurai J.: Structural basis of actin recognition and arginine ADP-ribosylation by Clostridium perfringens iota-toxin.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105(21):7399-404.
5) Sakuraba H, Yoneda K, Asai I, Tsuge H, Katunuma N. and Ohshima T.: Structure of 1-aspartate oxidase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii. Biochim Biophys Acta. 2008;1784(3):563-571.
6) Imagawa T., Iino H., Kanagawa M., Ebihara A., Kuramitsu S. and Tsuge H.: Crystal structure of the YdjC-family protein TTHB029 from Thermus thermophilus HB8:Structural relationship with peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase. Biochem Biophys Res Commun. 2008;367(3):535-541.
7) Kawazoe T., Park HK., Iwana S., Tsuge H. and Fukui K.: Human D-amino acid oxidase: an update and review. Chem Rec. 2007;7(5):305-315.
8) Sakuraba H., Yoneda K., Yoshihara K., Satoh K., Kawakami R., Uto Y., Tsuge H., Takahashi K., Hori H. and Ohshima T.: Sequential aldol condensation catalyzed by hyperthermophilic 2-deoxy-d-ribose-5-phosphate aldolase.Appl Environ Microbiol.2007;73(22):7427-7434.
9) Yoneda K., Sakuraba H., Tsuge H., Katunuma N. and Ohshima T.: Crystal structure of archaeal highly thermostable L-aspartate dehydrogenase/NAD/citrate ternary complex. FEBS Journal. 2007;274(16):4315-4325.
10) Kawazoe T., Tsuge H., Imagawa T., Aki K., Kuramitsu S. and Fukui K.: Structural basis of D-DOPA oxidation by D-amino acid oxidase:alternative pathway for dopamine biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 2007;355(2):385-391.
11) Kawazoe T., Tsuge H., Pilone MS. and Fukui K.: Crystal structure of human D-amino acid oxidase: context-dependent variability of the backbone conformation of the VAAGL hydrophobic stretch located at the si-face of the flavin ring. Protein Science. 2007;15(12):2708-2717.
12) Nakayama H., Shimamura T., Imagawa T., Shirai N., Itoh T., Sako Y., Miyano M., Sakuraba H., Ohshima T., Nomura N. and Tsuge H.: Structure of a Hyperthermophilic Archaeal Homing Endonuclease (HEase), I-Tsp061I: Contribution of Cross-domain Polar Networks to Thermostability. J Mol Biol. 2007;365(2):362-378.
13) Ago H., Oda M., Takahashi M., Tsuge H., Ochi S., Katunuma N., Miyano M. and Sakurai J.: Structural basis of the sphingomyelin phosphodiesterase activity in neutral sphingomyelinase from bacillus cereus. J Biol Chem. 2006;281(23):16157-16167.
14) Tsuge H., Kawakami R., Sakuraba H., Ago H., Miyano M., Aki K., Katunuma N. and Ohshima T.: Crystal structure of a novel FAD-, FMN-, and ATP-containing L-Proline Dehydrogenase Complex from Pyrococcus horikoshii. J Biol Chem. 2005;280(35):31045-31049.
15) Kawakami R., Sakuraba H., Tsuge H., Goda S., Katunuma N. and Ohshima T.: A second novel dye-linked L-proline dehydrogenase complex is present in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT-3. FEBS Journal. 2005;272(16):4044-4054.
16) Sakuraba H., Tsuge H., Yoneda K., Katunuma N. and Ohshima T.: Crystal structure of the NAD biosynthetic enzyme quinolinate synthase. J Biol Chem. 2005;280(29):26645-26648.
17) Bhuiya M. W., Sakuraba H., Ohshima T., Imagawa T., Katunuma N. and Tsuge H.: The first crystal structure of hyperthermostable NAD-dependent glutamate dehydrogenase from Pyrobaculum islandicum. J. Mol. Biol. 2005;345(2):325-337.
18) Yoneda K., Sakuraba H., Tsuge H., Katunuma N., Kuramitsu S., Kawabata T. and Ohshima T.: The first crystal structure of an archaeal helical repeat protein. Acta Cryst. 2005;F61(7):636-639.
19) Kuzuhara T., Suganuma M., Tsuge H. and Fujiki H.: Presence of a motif conserved between Helicobacter pylori TNF-α inducing protein (Tip α) and penicillin-binding proteins. Biol. Pharm. Bull. 2005;28(11):2133-2137.
| 研究室紹介::津下 英明 | 08:39 PM | comments (x) | trackback (x) |

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